注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
Boron carbide5-氯-1-戊炔 98%氟酸 49.5-50.5%溶液

Boron oxide3-氯苯乙炔 97%L-氨酰-L-谷胺酰胺 98%

Glass Fiber2-氯-6-甲氧基吡啶 97%N-氯代琥珀酰亞胺 98%

Quinacrine dihydrochloride氯甲基*基硅烷 98%肌酸，一 BR

2-Amifluorene6-氯-1-己烯 97%無(wú)肌酸 98%

2-Amipyrimidine2,5-二溴吡啶 99%肌酐 99%

5-Nitrouracil2,6-二溴吡啶 98%N,N-二甲基甘氨酸鹽酸鹽 99%

Antipyrine1,4-二乙炔基苯 97%三 AR,99.5%

Vaselineoil4,4'-二甲基-2,2'-聯(lián)吡啶 98%N-月桂酰肌氨酸鈉 98%

VaselineoilN,N'-二甲基乙二胺 96%萘甲唑啉鹽酸鹽 99%

Arlacel A1,8-二溴辛烷 98%鈀標(biāo)準(zhǔn)溶液 1000μg/ml,溶劑:2.0 mol/L HCl

Benzil2(2-吡啶)酮 98%鈀標(biāo)準(zhǔn)溶液 100μg/ml

Chrysene2,6-二叔丁基-4-甲基吡啶 98%氯化鋇溶液 1mol/L(2N)

Diphenylacetylene酮基膦酸二乙酯 96%溴標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.05000mol/L(0.1N)

Euparal1,4-二氯酞 98%硫酸鈰標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1000mol/L90.1N

Indan2,2'-聯(lián)吡啶 AR,99.0%銅標(biāo)準(zhǔn)溶液 1000μg/ml

2-氨基苯甲酰胺(>98.0%(HPLC)(T))Phospho-Drosophila Akt (Ser505) AntibodyIMP3/IGF-IIBP3  胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA 結(jié)合蛋白3抗體

羧氧基胺半鹽酸鹽(>98.0%(T))THEX1 (D66A11) Rabbit mAbILVBL  乙酰乳酸合成酶蛋白抗體

2-氟-1-甲基吡啶鎓對(duì)甲苯磺酸鹽(>98.0%(T))Phospho-Akt (Thr308) (244F9) Rabbit mAbILT2/CD85j  細(xì)胞表面免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄因子2抗體

1-(5-氟-2,4-二基)-4-甲基哌(>98.0%(HPLC)(T))Phospho-Akt (Thr308) (244F9) Rabbit mAbILP2  抑制細(xì)胞凋亡樣蛋白2抗體

吉拉德試劑 P(>95.0%(T))Phospho-Akt (Ser473) (193H12) Rabbit mAbILK-1  整合素連接激酶-1抗體

2-肼基吡啶(>98.0%(GC)(T))Phospho-Akt (Ser473) (193H12) Rabbit mAbILDR1  免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域受體1抗體

2-肼鹽酸鹽(>98.0%(T))Phospho-Akt (Ser473) (193H12) Rabbit mAbIL-9  白介素9抗體

4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(含氮量：23.50-24.30 %)Akt3 AntibodyIL-9  白介素9抗體

4-[3,5-二甲基-4-(4-硝基芐氧基)苯基]-4-氧代丁酸琥珀酰亞胺酯(>96.0%(HPLC))CT3 (D4K4N) Rabbit mAbIL-8/CXCL8  白介素8抗體

異酸對(duì)甲苯磺酰酯(>95.0%(T))Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAbIL-8/CXCL8  白介素8抗體
多瘤病毒PCR檢測(cè)試劑盒價(jià)格B淋巴細(xì)胞生發(fā)中心相關(guān)蛋白抗體Ergosterol glucoside中文名：麥角甾醇葡萄糖苷別名：分子式：C34H54O6

半乳糖凝集素7抗體Phyperulide E中文名：別名：分子式：C28H40O9

腸高血糖素相關(guān)肽抗體Withalide C中文名：醉茄內(nèi)酯C別名：分子式：C28H39ClO7

半乳糖凝集素8抗體Physapruin A中文名：別名：分子式：C28H38O7

半乳糖凝集素1抗體4β-Hydroxywithalide E中文名：4β-羥基醉茄內(nèi)酯E別名：分子式：C28H38O8
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。